Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Отчет'
Внедрение в работу с дошкольниками ряда современных программ и авторских технологий в соответствии с ФГТ внесли изменения в организацию педагогической...полностью>>
'Программа'
Области проявления компетенций: Желаемый результат в работе педагога Чему необходимо обучить педагога? Обоснованный выбор содержания, оборудования и т...полностью>>
'Документ'
Запрос котировок на закупку стоматологических материалов и изделий медицинского назначения для нужд государственного бюджетного учреждения здравоохран...полностью>>
'Документ'
ЗАО «Торговый дом Белтранссталь», далее именуемый "Поставщик", в лице директора Крупко С.Б.действующего на основании Устава, с одной стороны, и , имен...полностью>>

Главная > Литература

Сохрани ссылку в одной из сетей:
Информация о документе
Дата добавления:
Размер:
Доступные форматы для скачивания:

Московская Гимназия на Юго-Западе №1543

НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Роль метакаспазы Mca1p в образовании биопленок

клетками пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Н. Кашко

Научный руководитель:

к.б.н. Д. А. Кнорре

Москва

2013

Содержание

Введение………………………………………………………………………………………3

Обзор литературы….…………………………………………………………………………3

Материалы и методы…………………………………………………………………………7

Результаты…………………………………………………………………………………....11

Обсуждение……………………………………………………………………….………….15

Выводы………………………………………………………………………………….……16

Благодарности………………………………………………………………………….…….16

Литература……………………………………………………………………………….…...16

Введение

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются модельным объектом для генетических, биохимических и цитологических исследований. В геноме дрожжей обнаружены гены, гомологичные генам многоклеточных животных. Ген MCA1 кодирует дрожжевую метакаспазу, по функциям и строению напоминающую каспазы животных. Каспазы – это семейство цистеиновых протеаз, участвующих в процессе программируемой клеточной смерти (апоптозе) клеток. У многоклеточных организмов апоптоз необходим для поддержания постоянного количества клеток, замены старых клеток новыми, дифференцировки клеток во время эмбриогенеза и уничтожения инфицированных клеток. Было показано, что клетки дрожжей с инактивированным геном метакаспазы обладают повышенной устойчивостью к различным токсинам.

Дрожжи способны формировать колонии различной формы и сложности в зависимости от среды, на которой они растут. В таких колониях клетки дифференцированы и используют различные сигнальные молекулы для координации своего развития и метаболизма (Cap et al., 2012).

Мы решили исследовать роль метакаспазы при формировании биопленок клетками дрожжей S. cerevisiae. Для этого сначала мы собирались получить штамм с делетированным геном MCA1, затем проверить, будут ли клетки с такой делецией образовывать биопленки и оценить соотношение живых и мертвых клеток внутри колонии. Кроме того, мы планируем проследить развитие колонии мутантного штамма, а также штамма дикого типа на различных средах.

Обзор литературы

В обычных условиях, на твердых средах, богатых питательными веществами, дрожжи Saccharomyces cerevisiae формируют гладкие круглые колонии. Ограничение одного из основных питательных веществ может вызывать изменения в форме колоний. Например, при низкой концентрации источника азота диплоидные клетки дрожжей формируют псевдогифы – выросты, состоящие из нескольких удлиненных дрожжевых клеток (рис.1), а на полутвердых средах с содержанием агара 0,3% они образуют структуры, напоминающие биопленки (рис. 2A). Среди исследователей нет консенсуса на счет того, корректно ли называть такие структуры биопленками, но мы, следуя за Т. Б. Рейнольдсом (Reynolds et al., 2001), будем использовать этот термин для того, чтобы отличать данные структуры от других вариантов колоний сложной морфологии. Рост на средах с высоким содержанием агара под ультрафиолетовым облучением вызывает образование макроскопических столбиков (Engelberg, 1998).

Рис. 1. Примеры псевдогифального роста в колониях штамма дикого типа (справа) и мутантного штамма (слева). Фотографии взяты из работы (Ryan et al., 2012)

На средах с низким содержанием глюкозы клетки дрожжей образуют колонии сложной морфологии (рис. 2B), характеризующиеся сложной, организованной и специфической для каждого штамма структурой и моделью роста (Granek, 2010). Колонии сложной морфологии могут обеспечивать устойчивость клеток к химическим веществам и позволяют приспосабливаться к меняющимся условиям, что защищает клетки от неблагоприятной среды (Váchová, 2011).

Рис. 2. Примеры структур, формируемых клетками дрожжей: (А) структуры, напоминающие биопленки и (Б) колонии сложной морфологии. Фотографии колоний сложной морфологии взяты из статьи (Granek, 2013).

Было проведено много исследований для определения генов, регулирующих образование таких фенотипов.

За формирование биопленок в большей степени отвечают гены CYR1, FLO8 и FLO11 (Granek, 2013). CYR1 кодирует фермент аденилатциклазу, регулирующий образование цАМФ. Было показано, что в образовании биопленок и колоний сложной морфологии большую роль играет MAP-киназный каскад и цАМФ-протеинкиназный сигнальный путь (Granek, 2010). Эти же сигнальные пути регулируют экспрессию гена FLO11, который кодирует белок клеточной поверхности флокулин, отвечающий за адгезию клеток (Reynolds, 2001; Granek, 2013). Экспрессия FLO11 регулируется различными факторами транскрипции, например, RIM101 и FLO8 (Ryan, 2012).

FLO11 отвечает не только за адгезию между клетками, но и за прикрепление клеток к субстрату. Колонии клеток с инактивированным геном FLO11 легко смываются водой, в отличие от других штаммов, способных врастать в субстрат (Lo, 2012).

Адгезия – это один из важнейших факторов, позволяющих одноклеточным организмам скрещиваться, прикрепляться к субстрату или к клетке-хозяину и объединяться в многоклеточные колонии. Следовательно, ген FLO11 можно назвать основным геном, регулирующим появление таких фенотипов, как колонии сложной морфологии, биопленки и псевдогифы.

Важной особенностью сложных структур, формируемых клетками дрожжей, является дифференцировка входящего в их состав клеток. Клетки, расположенные в центре колоний, образуют активные формы кислорода (АФК). Кроме того в них наблюдается фрагментация хроматина, что является характерным признаком процесса самоликвидации клеток многоклеточных животных – апоптоза. Клетки, расположенные на периферии колонии, функционируют абсолютно нормально. Мертвые клетки в центре колонии выделяют в окружающую среду питательные вещества, которые потом могут помочь оставшимся клеткам выжить. Центральные и периферийные клетки колоний также различаются по уровню экспрессии некоторых белков, в частности антиоксидантных ферментов (Cáp et al., 2010). Было отмечено, что в дифференцированных культурах клеток дрожжей спорообразование происходит лишь в определенных участках колоний. Клетки в колониях способны передавать друг другу химические сигналы для координации своего метаболизма и развития (Voordeckers, 2012).

Было показано, что клетки дрожжей внутри колоний способны к межклеточной коммуникации. Одним из основных сигнальных веществ является летучий аммиак. Он может вызывать изменения в развитии соседних колоний и в метаболизме и дифференцировке входящих в их состав клеток (Palková, 1997). Образование и выделения аммиака регулируется концентрацией активных форм кислорода. Высокая концентрация АФК приводит к окислению ДНК, белков, жиров и прочих клеточных компонентов и в конечном итоге к смерти клетки. Однако определенная концентрация АФК в клетке вызывает образование аммиака и защелачивание клетками дрожжей окружающей среды (Cáp et al., 2012). Было показано, что колония, достигшая стадии интенсивного выделения аммиака, вызывает его выделение и в соседних колониях, независимо от их степени развития (Palková, 2000).

Дифференцировка клеток при развитии – одна из функций апоптоза у многоклеточных организмов. Поэтому можно предположить, что ген MCA1 влияет на дифференцировку клеток и на формирование биопленок и других сложных структур.

В клетках многоклеточных животных в процессе апоптоза происходит уплотнение цитоплазмы, сморщивание клеточной мембраны и фрагментация ДНК, после чего клетки распадаются на апоптотические тельца. Роль каспаз в этом процессе весьма велика. Они расщепляют белки ядерной ламины и цитоскелета и инактивируют белки, блокирующие апоптоз, что приводит к конденсации хроматина и расщеплению ДНК.

Уже есть сведения, что клетки дрожжей с делецией по метакаспазе не образуют биопленки. В результате работы (Ryan et al., 2012) ее авторы получили около 4000 штаммов с делециями по различным генам и проверили их способность к инвазивному росту и к формированию псевдогифов и биопленок. По их данным можно отметить несколько генов, вызывающих интерес (рис. 3). Штаммы с делециями по этим генам не образовывали биопленки, но росли примерно с такой же или с большей скоростью, чем штамм дикого типа (при произрастании на одной и той же чашке Петри). В числе генов, вызывающих интерес, находится и ген MCA1. Поэтому мы решили проверить, как инактивация этого гена влияет на фенотип, а также исследовать некоторые характеристики колонии, образованной штаммом SK1 mca1::KanMX4.

Рис. 3. Зависимость способности образовывать биопленки от скорости роста для различных нокаутных штаммов дрожжей S. cerevisiae (построено по данным Ryan et al. 2012). Каждая точка соответствует штамму, нокаутированному по одному из генов. Синим цветом обозначены штаммы, неспособные образовывать биопленки из-за низкой скорости роста; красным – штаммы, представляющие интерес для изучения специфических механизмов образования колоний сложной морфологии и биопленок.

Материалы и методы

Среды

Дрожжи выращивали на стандартной среде YPD:

2% бактопептона

1% дрожжевого экстракта

2% D-глюкозы

Среды автоклавировали. Для того, чтобы избежать карамелизации глюкозы, ее автоклавировали отдельно от других компонентов.

Для приготовления твердых сред добавляли 2% бактериального агара.

Для выращивания биопленок брали стандартную среду YPD и добавляли к ней 0,3% бактериального агара.

После трансформации колонии SK1 mca1::KanMX4 высевали на среду YPD с добавлением антибиотика генетицина (G418) до концентрации 230 мкг/мл.

Выделение суммарной ДНК из клеток дрожжей

Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и получения штамма SK1 mca1::KanMX4 мы выделили суммарную ДНК из клеток дрожжей штамма W303 mca1::KanMX4 по следующей схеме:

  1. Клетки дрожжей ресуспендировали в 200 мкл воды mQ

  2. Добавляли 200 мкл зимолиазы для разрушения клеточных стенок (и образования сферопластов)

  3. Добавляли 2 мкл β-меркаптоэтанола для разрушения дисульфидных мостиков в белках клеточных стенок

  4. Инкубировали 40 минут при t=37°С, периодически встряхивая пробирку

  5. Добавляли 50 мкл 10% SDS для разрушения мембран клеток

  6. Инкубировали 30 минут при t=65°С, периодически встряхивая пробирку

  7. Добавляли 300 мкл 9М ацетата аммония для осаждения жиров

  8. Охлаждали 40 минут при t=4°С

  9. Центрифугировали 10 минут на скорости 14000 оборотов

  10. Отбирали супернатант, добавляли к нему 0,7 объема изопропанола (450 мкл)

  11. Осаждали 10 минут при t=4°С

  12. Центрифугировали 10 минут на скорости 14000 оборотов

  13. Отбирали супернатант, осадок дважды промывали в 250 мкл 70% этанола, центрифугируя по 5 минут на скорости 14000 оборотов

  14. Осадок ДНК высушивали до отсутствия запаха спирта

  15. Растворяли ДНК в 50 мкл воды mQ

  16. Выделенную ДНК хранили при t=-20°С

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Для получения участка ДНК с маркерным геном KanMX4 и фланками гена MCA1 мы проводили ПЦР. В качестве матричной ДНК мы использовали суммарную ДНК, выделенную из штамма W303 mca1::KanMX4, в котором вместо гена метакаспазы был вставлен ген KanMX4. Праймеры были составлены к гену MCA1 с отступами в 200 пар нуклеотидов.

Для проведения ПЦР мы использовали LR-полимеразу.

Ход реакции:

  1. Первичная денатурация ДНК (t=94°С, 3 минуты)

  2. 30 циклов:

    1. Денатурация (t=94°С, 30 секунд)

    2. Отжиг праймеров (t=56°С, 30 секунд)

    3. Элонгация (t=72°С, 3 минуты)

  3. Заключительная элонгация (t=72°С, 5 минут)

Состав реакционной смеси ПЦР на 50 мкл с LR-полимеразой:

LR-буфер с Mg²⁺ 10x – 5 мкл

Нуклеотиды 25 mM – 0,5 мкл

Праймеры 10x — 5 мкл

Матричная ДНК — 0,5 мкл

LR-полимераза — 0,5 мкл

вода mQ – 38,5 мкл

Также мы проводили тестерную ПЦР с ДНК трансформантов, чтобы понять, правильно ли встроился ген. Для этого мы брали тестерные праймеры: один к гену MCA1 c отступом в 400 пар нуклеотидов, второй к гену KanMX4.

Для тестерной ПЦР мы использовали Taq-полимеразу, которая, в отличие от LR-полимеразы, рассчитана на более короткие участки ДНК и работает с большей скоростью, но с меньшей точностью.

Состав реакционной смеси ПЦР на 20 мкл с Taq-полимеразой:

Taq-буфер с Mg²⁺ 10x – 2 мкл

Нуклеотиды 25 mM – 0,2 мкл

Праймеры 10x — 2 мкл

Матричная ДНК — 0,2 мкл

Taq-полимераза – 0,2 мкл

вода mQ – 15,4 мкл

Мы использовали следующие праймеры:

для гена MCA1

прямой — 5'-AACTGACAAAACTGGATACT-3'

обратный — 5'-TAATGAAGAAAGATCAGGAG-3'

тестерные

прямой — 5'-AACTGGTACCCTAACGCTAG-3'

обратный — 5'-GACAGTCACATCATGCCCCT-3'

Электрофорез в агарозном геле

Полученные ПЦР-продукты мы проверяли методом электрофореза.

Он заключается в разделении участков ДНК в геле. Под действием электрического поля отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся от — к +, причем быстрее движутся более короткие участки. Таким образом происходит разделение участков ДНК по длине. Сравнивая их с ДНК уже известной длины можно определить примерную длину полученной молекулы ДНК.

Мы готовили 1% агарозный гель на 60 мл (0,6 г агарозы и 60 мл 1x TAE-буфера) с добавлением бромистого этидия.

Трансформация

Для получения штамма SK1 mca1::KanMX4 мы проводили трансформацию с полученным ПЦР-продуктом (кассетой KanMX4 с фланками гена MCA1) и со штаммом SK1.

План трансформации:

  1. Клетки ресуспендировали в 200 мкл литий-ацетатного буфера (1% 1М LiAc, 2% 50mM Tris-HCl (pH=7,5), 0,2% 0,5M EDTA), инкубировали 15 минут при t=30°С

  2. Центрифугировали на скорости 4000 оборотов 2 минуты

  3. Отбирали супернатант, клетки ресуспендировали в 70 мкл литий-ацетатного буфера, инкубировали 15 минут при t=30°С

  4. Добавляли 4 мкл ДНК-носителя из спермы лосося, 10 мкл ПЦР-продукта и 120 мкл 50% ПЭГ-4000

  5. Инкубировали 30 минут при t=30°С

  6. Тепловой шок — 15 минут при t=42°С

  7. Добавляли 1,5 мл жидкой YPD и инкубировали 3-4 часа

  8. Высевали на чашки с антибиотиком генетицином

Результаты

Далеко не все лабораторные штаммы дрожжей Saccaromyces cerevisiae способны к образованию колоний сложной морфологии и биопленок. Поэтому, для работы мы взяли два гаплоидных штамма SK1 a и SK1 alpha, способные к такой дифференцировке. Затем

мы выделили полную суммарную ДНК из штамма W303 mca1::KanMX4, поставили ПЦР с выделенной ДНК и с праймерами к гену MCA1 с отступами в 200 пар нуклеотидов.

Рис. 4. Схема получения штамма SK1 mca1::KanMX4.

Сама кассета KanMX4 имеет длину около 1600 пар нуклеотидов. Учитывая фланки гена MCA1, необходимые для того, чтобы кассета вставилась в нужное место в геноме, общая длина ПЦР-продукта должна составлять около 2000 пар нуклеотидов. Продукт ПЦР проанализировали с помощью горизонтального электрофореза на агарозном геле (рис. 5).



Рис. 5. Электрофорез с продуктами ПЦР. 1 – маркерная дорожка, 2-5 – ПЦР с суммарной ДНК из штамма W303 mca1::KanMX4 и с праймерами к гену MCA1 (2, 3 и 4 отличаются температурой отжига праймеров — 52°С, 54°С и 56°С соответственно, в ПЦР № 5 взято 0,1 мкл ДНК, температура отжига праймеров 56°С), 6, 7 – контрольные ПЦР. В качестве контрольных ПЦР использовали ПЦР-смеси с выделенной ДНК из штамма W303 mca1::KanMX4 и тестерными праймерами (дорожка 6) и с праймерами к гену MCA1, но с другой ДНК - W303 Δnde2 (дорожка 7).

Как видно из рисунка, в том случае, когда в качестве матричной ДНК была взята ДНК, выделенная из штамма W303 mca1::KanMX4 (рис. 5, дорожки 3-5), продукт ПЦР оказалася несколько большего размера, чем в случае ПЦР с матрицей из контрольного штамма W303 Δnde2, содержащей последовательность метакаспазы дикого типа, что соответствовало ожиданию.

Полученный ПЦР-продукт мы протрансформировали в штамм SK1 и получили необходимый мутантный штамм SK1 mca1::KanMX4. Для проверки того, правильно ли вставился полученный нами участок ДНК с геном KanMX4 в геном, мы провели тестерную ПЦР с суммарной ДНК, выделенной из штамма SK1 mca1::KanMX4, и с праймерами, составленными к гену MCA1 с отступом в 400 пар нуклеотидов и к гену KanMX4 (рис. 6). При таких праймерах ПЦР может дать продукт заданного размера (550 п.н.) только в том случае, если KanMX4 встроился в геном вместо гена метакаспазы. Как видно из рисунка 7, в трех случаях нам удалось получить продукт ПЦР заданного размера, таким образом мы получили штаммы SK1 mca1::KanMX4 mat a и SK1 mca1::KanMX4 mat alpha.

Рис. 6. Схема тестерной ПЦР для проверки трансформации.

Длина ПЦР-продукта должна составлять примерно 550 пар нуклеотидов.

Рис. 7. Электрофорез с продуктами тестерной ПЦР. 1 – маркерная дорожка, 2, 3, 4 – ПЦР с суммарной ДНК из штаммов SK1 mca1::KanMX4 mat a и SK1 mca1::KanMX4 mat alpha и W303 mca1::KanMX4 соответственно, 5 – отрицательный контроль (W303 Δnde2)

Для проверки нашей гипотезы мы высевали клетки полученного штамма на среды с низким содержанием агара. В качестве контрольных штаммов мы использовали W303, W303 mca1::KanMX4 и SK1.

Штаммы SK1 mca1::KanMX4 mat a и SK1 mca1::KanMX4 mat alpha не проявляли фенотипических отличий от штамма SK1.

Рис. 8. Фотографии биопленок, формируемых исходными штаммами SK1 a и SK1 α, полученными штаммами SK1 mca1::KanMX4 mat a и SK1 mca1::KanMX4 mat alpha и штаммом дикого типа W303

Обсуждение

Электрофорез продуктов тестерной ПЦР показывает, что у полученных нами мутантов действительно делетирован ген MCA1 (рис. 7). Однако отсутствие ПЦР-продукта в контроле может быть вызвано ошибкой при проведении ПЦР.

Чтобы проверить результаты, в нашей лаборатории провели еще одну серию ПЦР с полученными штаммами-трансформантами и с внешними праймерами к гену MCA1. Эти ПЦР позволили бы определить длину полученного участка гена MCA1 и, следовательно, понять, вставился ли туда ген KanMX4 (так как длина гена KanMX4 около 1600 пар нуклеотидов, а длина MCA1 – 1250).

Выяснилось, что в штамме SK1 mca1::KanMX4 ген метакаспазы действительно заменился на ген KanMX4. Из этого можно сделать вывод, что ген MCA1 не влияет на образование биопленок.

Так как наша гипотеза не подтвердилась, мы не стали дальше исследовать морфологию штамма SK1 mca1::KanMX4.

В статье (Ryan et al., 2012) авторы обнаружили, что клетки дрожжей с делецией по метакаспазе не образуют биопленки. Однако они использовали другой штамм дрожжей. Можно предположить, что мутация по MCA1 проявляется только при наличии других мутаций, характерных для используемого ими штамма.

В дальнейшем стоит проверить, будут ли другие штаммы, способные к образованию сложных колоний, формировать биопленки при делеции метакаспазы, и выяснить, какие мутации могут влиять на проявление мутации по MCA1. Также можно нокаутировать другие гены, предположительно участвующие в процессе апоптоза.

Выводы

    1. Получены штаммы SK1 mca1::KanMX4 mat a и SK1 mca1::KanMX4 mat alpha.

    2. Делеция гена метакаспазы не предотвращает образование биопленок клетками штамма SK1

Благодарности

Я благодарю моего научного руководителя Дмитрия Алексеевича Кнорре; Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики; сотрудников лаборатории молекулярной биологии дрожжей за помощь в проведении работы.

Литература

1. Cáp M., Váchová L., Palková Z. How to survive within a yeast colony? Communicative & Integrative Biology, 2010, vol. 3, № 2, pp. 198-200

2. Cáp M., Váchová L., Palková Z. Reactive oxygen species in the signaling and adaptation of multicellular microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2012, vol. 2012, article ID 976753.

3. Engelberg D. et al. Multicellular Stalk-Like Structures in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology, 1998, vol. 180, № 15, pp. 3992–3996

4. Granek J.A., Magwene P.M. Environmental and Genetic Determinants of Colony Morphology in Yeast. PLoS Genetics, 2010, vol. 6, № 1, pp. 1-12

5. Granek J.A., Murray D., Kayrkçi Ö., Magwene P.M. The genetic architecture of biofilm formation in a clinical isolate of Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2013, vol. 193, № 2, pp. 587-600

6. Lo T.L. et al. The mRNA decay pathway regulates the expression of the Flo11 adhesin and biofilm formation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2012, vol. 191, № 4, pp. 1387-1391.

7. Palková Z. et al. Ammonia mediates communication between yeast colonies. Nature, 1997, vol. 390, № 6659, pp. 532-536

8. Palková Z., Forstová J. Yeast colonies synchronise their growth and development. Journal of Cell Science, 2000, vol. 113, № 11, pp. 1923-1928

9. Reynolds T.B., Fink G.R. Bakers' Yeast, a Model for Fungal Biofilm Formation. Science, 2001, vol. 291, № 5505, pp. 878-881

10. Ryan O. et al. Global gene deletion analysis exploring yeast filamentous growth. Science, 2012, vol. 337, № 6100, pp. 1353-1356

11. Váchová L. et al. Flo11p, drug efflux pumps, and the extracellular matrix cooperate to form biofilm yeast colonies. Journal of Cell Biology, 2011, vol. 194, № 5, pp. 679-687

12. Voordeckers K. et al. Identification of a complex genetic network underlying

Saccharomyces cerevisiae colony morphology. Molecular Microbiology, 2012, vol. 86, № 1, pp. 225–239



Похожие документы:

  1. Роли организаций и пользователей при использовании эцп

    Документ
    ... площадок (с другой стороны). Роли пользователей Роли пользователей, указываемые в ... в зависимости от роли пользователя. Роль организации Роль пользователя Действия, ... заявок пользователей организации с ролью «Уполномоченный специалист»; Регистрация ...
  2. Роль социальной сферы и социальной политики в обеспечении устойчивого социально-экономического развития страны

    Документ
    ... отраслевого состава, места и роли в системе отношений национального воспроизводства ... людей данной страны. Однако центральную роль в этом взаимодействии и, соответственно, ... социальную устойчивость. С учетом роли человеческого и социального капитала ...
  3. Роль театрализованной деятельности в развитии дошкольника

    Документ
    ... один и прорепетировать какую-нибудь роль или просмотреть иллюстрации к театрализации ... детей; - распределение ролей по карточкам; - проигрывание ролей в парах. Для ... в) мимика. 2. Индивидуальная работа по ролям. 3. Закрепление. IV. 1. Объединённая ...
  4. Роль гражданского общества в современной социальной политике России

    Документ
    ... проблем является опыт перераспределения ролей между государством и ... основных государственных институтов, перераспределение ролей в экономике, радикальный отход ... метод. В современной России роль негосударственных институтов в реализации социальной ...
  5. Роль преподавателя в среде eLearning

    Документ
    ... предельном случае,- отсутствует вовсе. Возрастание роли информального образования в информационном обществе, ... средствами ИКТ устаревших ролей преподавателя, присущих традиционной ... серьезно пересмотреть его роли. Роль его нам представляется прежде ...
  6. Роль музыки в развитии эмоциональности ребенка

    Документ
    ... инструментах) при условии ведущей роли выразительности в детском исполнении, ... что в данном случае важнейшую роль играет профессиональная компетентность педагога и ... исследовавшие эмоции, отмечают их мотивирующую роль, связывают эмоции с потребностями и ...

Другие похожие документы..