Поиск

Полнотекстовый поиск:
Где искать:
везде
только в названии
только в тексте
Выводить:
описание
слова в тексте
только заголовок

Рекомендуем ознакомиться

'Документ'
45. О прославленный, как же случилось, что оба мы в заблуждении, хотя изнаем? Что за наваждение овладело им и мной, не распознающими в слепоте(действи...полностью>>
'Документ'
Итак, вы начинаете самостоятельный путь по широкой жизненной дороге, вы достигли той свободы, о которой долго мечтали. С чего начать и как правильно п...полностью>>
'Методико-библиографическое пособие'
«Течет река Волга…» : методико-библиогр пособие : к Всемирному дню воды / Волгогр. ОУНБ им. М. Горького, Отдел СХЛиЭИ ; [сост. Н. И. Политова ; ред. Т...полностью>>
'Документ'
10 Т. А. Щербинина Дни библиографии: «Город с книгой» Б-ка №7 13.10 Л.А. Нелипа «Искусство быть читателем» Б-ка №8 1....полностью>>

Главная > Документ

Сохрани ссылку в одной из сетей:
Информация о документе
Дата добавления:
Размер:
Доступные форматы для скачивания:

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение однородности ОФС 42-

сывороточных препаратов Вводится взамен метода

методом электрофореза изложенного в ФС

на плёнках из ацетата 42-3874-99

целлюлозы

________________________________________________________________

Метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы предназначен для определения однородности (идентичности) сывороточных иммунобиологических лекарственных средств (иммуноглобулинов).

Метод основан на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в зависимости от соотношения основных и кислотных групп белка, рН, ионной силы буферного раствора, величины заряда и молекулярной массы частиц. По скорости движения белков в электрическом поле они делятся на основные 5 фракций: альбумины, глобулины α-1, глобулины α-2, β – глобулины и γ - глобулины.

Белки движутся в электрическом поле со скоростью пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд движутся к аноду (+), а положительно заряженные белки – к катоду (-). Наименьшей скоростью продвижения обладают γ - глобулины, они практически остаются на линии старта их заряд близок к нейтральному (молекулярная масса 150 тыс. кДа). Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой (67-70 тыс. кДа), поэтому в электрическом поле они двигаются с наибольшей скоростью и дальше других фракций находятся от линии старта. С меньшей скоростью в электрическом поле движутся глобулины α-1 , глобулины α-2 и β – глобулины.

Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы

На увлажнённую плёнку из ацетата целлюлозы размером 90х90 мм, заправленную в специальную рамку, наносят (2-4 мкл) исследуемых образцов лекарственного средства (5 образцов в 2-х параллельных определениях) и для идентификации контрольный образец – сыворотка для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций (определение проводят в 2-х параллельных определениях). Предварительно в электродные секции камеры (аппарат для электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы) наливают барбиталовый буферный раствор (рН 8,4) (вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой подходящий коммерческий буферный раствор, с указанным рН).

Рамку с пленкой из ацетата целлюлозы помещают в разделительную камеру, закрывают крышкой, включают источник питания (сила тока 8-10 мА, напряжение 100-129 В). Разделение проводят в течение 30-40 мин. После проведения электрофореза снимают крышку разделительной камеры, не допуская попадания конденсационной воды на пленку. Рамку с плёнкой извлекают из камеры, избегая контакта с участками, где происходил электрофорез испытуемых образцов. Пленку достают из рамки пинцетом и дают подсохнуть на воздухе. Затем плёнку обрезают с обоих концов (около 2,5 мм), помещают в кювету с 50 мл раствора красителя и выдерживают в течение не более 5 мин (т.к. выдерживание более 5 мин деформирует плёнку). Плёнку вынимают из кюветы и после стекания избыточной жидкости помещают на 5 мин поочерёдно в 3 кюветы, со 100 мл отмывочной жидкости (для ускорения процесса отмывки кювету покачивают). После отмывки фон плёнки должен приобрести бледно-голубое окрашивание или стать почти прозрачным. Далее плёнку тщательно промывают водой, помещают между листами фильтровальной бумаги и слегка промакают.

Идентификацию белковых фракций проводят путём сравнения электрофореграммы испытуемых образцов с электрофореграммой контрольной сыворотки для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Сыворотка должна разделиться не менее, чем на 5 фракций: альбумин, α1 и α2 – глобулины, β - глобулин и γ – глобулин. После проведения электрофореза проводят количественное определение фракций иммуноглобулина путём извлечения краски из плёнки элюирующим раствором с последующим колориметрированием или путём денситометрии электрофореграмм.

Количественное определение фракций иммуноглобулина.

Колориметрическое определение.

Извлечение краски каждой фракции проводят в 3 мл элюирующего раствора с 2-х параллельных электрофореграмм. Элюцию проводят в течение 40 мин при многократном встряхивании. Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по отношению к элюату неокрашенного участка электрофореграммы. Сумму оптических плотностей всех фракций принимают за 100 % и рассчитывают процентное содержание каждой фракции иммуноглобулина.

Денситометрическое определение.

Электрофореграммы исследуемых образцов высушивают между листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовом пакете (условия высушивания исключают деформацию плёнки). Высушенные плёнки просветляют вазелиновым маслом. Плёнки пропитывают вазелиновым маслом таким образом, чтобы в плёнке не остались пузырьки воздуха. Плёнку следует держать горизонтально и нижней поверхностью осторожно касаться масла. Избыток вазелинового масла удаляют, промокая плёнку между листами фильтровальной бумаги.

Фракции иммуноглобулина записанные денситометром представлены в виде пиков. Величина площади каждого пика, пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком. Площадь каждого пика вычисляют по формуле площади прямоугольника (h x d, где h – максимальная высота пика, d – ширина пика). Сумму площадей всех пиков фракций иммуноглобулина принимают за 100 % и вычисляют процентное содержание каждой фракции.

Примечания

Подготовка плёнки из ацетата целлюлозы. Плёнку смачивают в барбиталовом буферном растворе, гладкой стороной помещают в кювету на поверхность буферного раствора на 2 мин, а затем пинцетом погружают на дно кюветы и выдерживают 5 мин. Плёнку вынимают пинцетом, избыток влаги удаляют между листами фильтровальной бумаги и заправляют в рамку, избегая неравномерного натяжения и провисания.

Подготовка испытуемых образцов. Испытуемые образцы предварительно, обрабатывают 0,05 % раствором красителя - бромфенолового синего, используемого для отслеживания продвижения и распределения фракций иммуноглобулина в процессе электрофореза. В пробирку типа Эппендорф помещают 100 мкл испытуемого образца и 10 мкл 0,05 % раствора бромфенолового синего и перемешивают. Окрашенные испытуемые образцы в объеме 24 мкл помещают в каждую лунку лотка. Приготовление барбиталового буферного раствора (рН 8,4)*. 8,5 г барбитал-натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 600-700 мл воды, прибавляют 11 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты доводят объём раствора водой до метки и перемешивают.

*Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой коммерческий буферный раствор.

Приготовление 1 М раствора хлористоводородной кислоты. 85 мл хлористоводородной кислоты концентрированной помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объём раствора до метки и перемешивают.

Приготовление красителя. К 0,5 г амидочёрного 10 Б (импортный) прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл спирта и перемешивают. Для полного растворения краситель оставляют на 24 ч. Перед использованием раствор красителя перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Приготовление раствора для отмывки электрофореграмм. 40 мл ледяной уксусной кислоты помещают в мерный цилиндр вместимостью 1 л, прибавляют 700 мл воды и перемешивают. Затем объём раствора доводят водой до метки и вновь перемешивают.

Приготовление элюирующего раствора. Смешивают 1 М раствор натрия гидроксида с 1 М раствором натрия эдетата в соотношении 10 мл 1 М раствора натрия гидроксида и 1 мл 1 М раствора натрия эдетата.



Похожие документы:

  1. Федеральное агентство по здравоохранению

    Документ
    ... препарата. Методы испытаний. Как правило, в Общей фармакопейной статье (ОФС ... перемешивания, обеспечивающее однородность температуры внутри ... ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА (ОФС 42-0053-07) Определение ... препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный ...

Другие похожие документы..